潔凈無菌車間的濕熱滅菌

為了滿足特定物品的無菌要求和質量穩定性，有必要開發與被滅菌物品相適應的濕熱滅菌程序，滅菌程序的開發是確定滅菌工藝的各項物理參數的過程。滅菌程序的開發應列入正式的開發計劃并有相應的文件和記錄。本文將以濕熱滅菌柜為例進行濕熱滅菌程序的開發。

（1）設計滅菌方法

滅菌程序設計方法主要有兩種。其中一種是殘存概率法。兩種方法都可以使被滅菌物品達到相同的無菌保證水平，選擇哪種設計方法很大程度上取決于被滅菌物品的熱穩定性。但殘存概率法要求的熱能較小，有利于被滅菌物品的穩定性。

殘存概率法   不耐熱產品或物品的滅菌不能使用另一種方法，這就需要所建立的滅菌程序必須能恰當地去除微生物，但不能導致產品或物品的降解。這樣的滅菌周期的建立有賴于研究產品或物品上的微生物數量和耐熱性。一旦確定了微生物的數量和耐熱性，就可以設計出一個能達到 SAL小于 10^-6的滅菌程序。

殘存概率法設計時，N₀和 D_T的取值要基于產品或物品在滅菌前污染菌含量檢測數據，另需加上安全余地，它取決于以下方面：

a.    專業判斷；

b.    生物負荷數據的范圍；

c.    對于產品生物負荷常規測試的程序。

按 GMP 規范生產的產品，實際微生物初始數量應該很低。通常每個容器 1～100 個菌。通常說來，只有環境中形成的芽孢或從產品分離的芽孢才需要測試 D 值。將產品在80～100℃下加熱 10～15mm，可以篩選掉耐熱性差的微生物。D_T值的選擇應將初始微生物試驗中檢出的耐熱菌的安全系數考慮在內。所選定的安全系數反過來又與初始微生物的數量和耐熱性測試的頻率和程度相關。

      假設產品的生物負荷測試中：

N₀=10²;D_121℃=1min；Z-10℃

利用以上數值，可以計算出經 121℃滅菌，微生物現存概率小于 10^-6所需的F_PHY和F_BIO如下：

F₀=F_PHY=F_BIO= D_121℃ X（lg N₀-lgN_F）=8min

殘存概率法設計的滅菌工藝，通常要求對每批產品天菌前進行微生物含量及耐熱性測試，積累微生物污染的數據。如果長期以來的數據證明在實際的 GMP 控制條件下，污染水平很低，且檢不到耐熱菌，污染菌監控的方案可做適當調整。

（2）確定裝載類型

滅菌工藝開發的下一個步驟是確定滅菌物品的種類，確定裝載類型。滅菌物品通常劃分為多孔/堅硬裝載和液體裝載。不同裝載類型應選擇合適的滅菌方法。

①多孔/堅硬裝載    多孔/堅硬裝載是指直接接觸飽和蒸汽來實現滅菌的物品。當蒸汽在被滅菌物品的表面冷凝時，發生熱量轉移。多孔/固體物品包括但不局限于下述內容：

a.    過濾器《薄模式過濾器、簡式過濾器、預過濾器等）；

b.    膠賽和其他聚合物密封件；

c.    管道和軟管；

d.    工作；

e.    清潔設備；

f.     設備部件。

②液體裝載    液體裝載的滅菌通過傳導和（或）對流作用，將能量傳遞給容器中的內容物。液體裝載包括但不局限于以下內容：

a.容器（如小瓶、袋、瓶子，針筒或安瓿）的液體（溶液、懸浮液和/或乳劑）；

b.實驗后或生產后需處理的含有潛在致病微生物的廢液。

（3）選擇滅菌程序

對于濕熱滅菌來說，有兩種常用的滅種程序：飽和蒸汽滅菌程序和空氣加壓滅菌程序。飽和蒸汽滅菌程序通常用于多孔/堅硬裝載滅菌，空氣加壓滅菌程序常用于液體裝載滅菌。中凈環球凈化可提供潔凈車間、無菌車間、無菌實驗室等凈化工程的咨詢、規劃、設計、施工、安裝改造等配套服務。

下面對這兩種滅菌程序做簡要介紹。

①飽和蒸汽滅菌程序    按滅菌前排除空氣的方式不同，飽和蒸汽滅菌程序分為脈動真空滅菌程序和重力置換滅菌程序。

a.脈動真空滅菌程序    脈動真空滅菌程序在滅菌前通過機械真空泵將空氣從腔室中抽走，常用于難以去除空氣的多孔/堅硬裝載的滅菌，比如軟管，過濾器和灌裝機部件。滅菌程序開始之前，對裝載的處理很重要。如果每次抽真空至 0.1 個大氣壓，那么每個脈沖（抽真空-充蒸汽）將使滅菌柜內的空氣減少 90%或者 1 個對數單位。三次脈沖可使滅菌柜內的空氣下降 3 個對數單位，有效地將空氣去除 99.9%。為了使裝載處于正常狀態，可能另需正壓脈沖（充蒸汽至高于大氣壓，避免空氣進人腔室)。通過這個方法，提高去除空氣的效率，縮短平衡時間。在制定滅菌程序時，要準確地確脈沖的衣數和類型。

b.重力置換滅菌程序    重力置換滅菌程序的原理在于滅菌柜腔室中的冷空氣比進入的蒸汽重，冷空氣被從腔室頂部輸入的蒸汽往下排擠到腔室的底部，并通過腔室底部的排水管排出。蒸汽往往通過導流擋板或散流器輸至滅出柜腔室。蒸汽注入腔室的速度非常關鍵，如果蒸汽進入過快或分布不合理，裝載的頂部或周圍可能會夾帶空氣層。如果進汽過于緩慢，空氣受熱而擴散入蒸汽中，從而使排除空氣更加困難。

重力置換滅菌程序排除空氣的效率低于脈動真空滅菌程序，對排氣比較閑難的裝載而言，不建議采用這類天菌程序。

② 空氣加壓滅菌程序    對于液體裝載滅菌，液體容器頂部常留有小部分氣體（空氣氮氣或其他惰性氣體)。當液體被加熱時，頂部氣體膨脹，容器中的壓力隨之增大。冷卻階段，容器內的溫度高于容器外，容器內的壓力也會比腔室內壓力大。為保持容器的形狀和密封完好性，需空氣加壓，增大腔室的壓力，降低腔室和容器內的壓差。加壓滅菌程序通常采用無油壓縮空氣，通入腔室的空氣須先經過除菌過濾器過濾。為防止加入冷空氣會引起腔室內的溫度波動，空氣在通人腔室前要預熱。常見的空氣加壓程序有蒸汽-空氣混合滅菌程序(SAM)和過熱水滅菌程序。

a.蒸汽-空氣混合滅菌程序    該程序以空氣和蒸汽混合物為加熱介質。當蒸汽中加入空氣，產生高于一定溫度下飽和蒸汽壓的壓力，這種滅菌程序即為蒸汽-空氣混合況圈程序。與飽和蒸汽滅菌相比。它的熱傳遞速率低，滅菌結束后，常見的冷卻方法是向滅菌柜夾套通入冷卻水，保持空氣循環冷卻，也可通過在裝載上方噴淋冷卻水使其降溫。

b.過熱水滅菌程序    過熱水滅菌程序是指在空氣加壓條件下，以過熱水為加熱介質進行滅菌。這個程序中，加壓是為了保持水在高溫下的液體狀態。

（4）多孔/堅硬裝載滅菌程序開發要素

多孔/堅硬裝載滅菌重現性和獲取無菌保證水平的大風險是單個產品中可能夾帶的空氣，因此滅菌前，應確保充分地排除滅菌柜腔室和產品中的容氣，同時滅菌過程確保向滅菌柜提供干飽和蒸汽。通常多孔/堅硬裝載滅菌程序的開發需要從以下方面進行考慮。

①裝載最冷點    在腔室熱穿透試驗前進行熱分布研究，量出裝載的分布圖，確定滅菌     品中適當的監控點位置，確定裝載中很難加熱的部位。

裝載的溫度測試應取難加熱的物品(如質量大的、易包藏空氣的、長的軟管、或這類特性兼備的裝載物品)。做溫度分布圖時，要比較裝載類型對加熱的影響(如比較排除空氣的難易及大裝載加熱的難易程度)，并將溫度探頭放置在很難加熱的位置。

②裝載準備    多孔/堅硬裝載的準備方式可有多種，包括但不局限于以下示例：

a.用可穿透蒸汽和空氣的包裝材料將裝載包扎（如不脫落纖維的紙或其他聚合包裝材料）；

b.加蓋但不封閉的桶/盒;

c.無菌生產中所用的物品必須加以包裝或包扎，以便在使用之前保持無菌狀態。包裝材料需要考慮空氣及冷凝水的排除。避免微生物污染。

③裝載方式    在運行確認后及性能確認前，要確認裝載的類型和方式，并有相應記錄裝載方式的確定應考慮以下方面。

a.裝載不能接觸腔室內壁。

b.盡可能減小金屬容器平面間的接觸以及與滅菌車之間的接觸。

c.為方便去除空氣及冷凝水，明確裝載物的方位并有相應記錄，如將桶倒置。

d.質量大的裝載應放在腔室中較低的架子上，盡量減少冷凝水所致的裝載潮濕.

e.控制滅菌柜中裝載物的數量，如果預期裝載物的量是變化的，則需確定最小和最大裝載量。

f.如果確認表明物品的擺放位置不影響滅菌效果，那么裝載方式是可變的.

g.應制定適當的SOP,便于相關操作人員執行操作。

④運行參數    建立滅菌程序的關鍵要素是確定運行參數，以滿足滅菌工藝設計的目標并確定它們屬關鍵因素或重要因素。

關鍵參數涉及產品的安全和有效性。關鍵參數不合格可能會導致滅菌的失敗，參數不合格時被滅菌產品不得放行。重要參數保證日常滅菌運行處于“受控”狀態。重要參數不合格時。需進行調查并有說明合理處理裝載的文作和記錄。

⑤平衡時間    平衡時間表示去除空氣并使裝載達到滅菌條件的能力。即使達到了設定的滅菌溫度，平衡時間的延長也表示去除空氣或加熱能力的不足。在程序開發中，盡可能減小平衡時間，采用以下方法可縮短平衡時間。

a.確認裝載正確放置，有效排除空氣（如膠管不受擠壓)；

b.增加真空或蒸汽正脈沖的次數；

c.提高真空脈沖的真空度；

d.優化裝載方式。

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